前情提要 结束后，玩家／Desmond进入Ezio的一段记忆（Sequence 9），但内容异常混乱。接下来，Ezio的记忆跳回1499年12月的梵蒂冈（《刺客教条2》的尾声），与「女神」Minerva于西斯汀教堂地窖的相 遇。Minerva留下了谜语般的一句话「接下来靠你了...Desmond」后便消失无踪，满腹狐疑的Ezio步出地窖，发现先前倒地的教宗亚历山大六 世／Rodrigo Borgia已逃之夭夭，他的权杖也自动封入地底。
这时Ezio的叔叔Mario正好赶来，待Ezio爬出地窖（按住Y键不放打开Eagle Vision可看到攀爬点）后，两人一同离开梵蒂冈。来到河畔，Ezio不知是否该把依甸残片之一的苹果丢入河里，犹豫许久后，Mario要Ezio先把苹果交给他，之后再处理。两人回到Monteriggioni庄园（二代的基地），受到众人的欢迎。Ezio的妹妹Claudia出来迎接，并问起敌人的状况，Ezio要她 召集阿萨辛的成员在今晚会面。玩家在Monteriggioni庄园里跟随地图上代表任务的惊叹号与导航点完成三个简单的事件（拾取东西并跟随NPC／骑 马／使用大炮）、熟悉游戏的流程后，就能回到别墅门口，与Caterina Sponosa碰面并与阿萨辛同志会谈。
然而，会谈中众人对于Ezio留了Rodrigo Borgia一命皆感惊讶，马基维利（Niccolo Machiavelli）认为Ezio此举后患无穷，还因此而气冲冲地离去。
回到卧房，Ezio与Caterina一夜春宵，醒来时却发现庄园遭人突袭。Ezio套上外衣就赶紧从炮击留下的缺口一跃而出，发现整座城池遭到 Borgia一族的勐烈攻击。Mario叔叔率兵从正门迎敌，Ezio则骑马朝城墙赶去，操作大炮阻挡敌人攻势、为镇民争取避难的时间。
策马奔至城墙，从倒塌楼梯处的墙垣缺口往上爬，就会触发城墙耐久度的倒数计时：玩家要在倒数结束、城墙全毁前尽快操作大炮摧毁敌方炮台（地图上的红点），让 镇民全数逃出（0／500）。操作大炮时记得瞄准两座炮台的中央射击，如此一来可同时摧毁两座炮台，也才够争取足够的时间。摧毁一定数量的炮台 后，Ezio得操作另一座大炮，尽快摧毁敌方炮台，已完成这个任务。
接下来，敌方的攻城塔会搭上城墙，Ezio只好赶去拦截进入城内的士兵。利用墙边的台踢（按住RT键并朝其移动）就能瞬间飞上楼顶，从楼上飞跃刺杀一名敌兵 后，再用近战打倒残存的敌人。近身战的操作方式和前作相同，X键砍杀、RT键格挡，当敌人头上的体力表闪烁白光时表示他即将发动攻击，这时抓准对方出招时 间，按住RT键不放的同时按下X键便能格挡反击，一招击杀敌人。杀死一名敌人后，Ezio便能进入连杀状态，在攻击不中断的状态下只要攻击命中就能立即击 杀敌人，多多练习对今后的战斗很有帮助。
打倒城墙上的入侵者，Ezio往下瞧见Mario叔叔无力地瘫倒在地，Rodrigo Borgia之子Cesare Borgia与Lucrezia Borgia得意洋洋地尾随在后，后方押着Caterina的Cesare手里还拿着苹果。Cesare Borgia以Mario为饵，持枪作势要杀害之；就在Ezio急切地奔上屋顶时，城墙上火枪齐发，将Ezio击落于地。
城里的佣兵救起了身负重伤的Ezio，一群人急忙朝别墅撤退。击退沿途的敌人来到别墅，发现Claudia正遭到Borgia士兵的攻击。解救妹妹并掩护她 朝别墅里的密道前进（别离她太远），进入别墅后Ezio就能带着母亲与妹妹从庄园北侧的密道离开。Ezio告知两人Mario的死讯，请妹妹带着母亲前往 翡冷翠（Firenze）避难，自己一人挺着伤势隻身前往罗马；独行至夜，Ezio却重伤难耐，昏迷落马...
场景回到现在，阿萨辛小组躲避Abstergo Indistries／圣殿武士的追捕，驱车来到Monteriggioni庄园。车上，Desmond的回忆之旅突然中断，小组工程师Rebecca也 无法追踪Ezio记忆里依甸残片的所在；为了找到Minerva口中的其他圣殿所在，Lucy认为众人必须找出Eizo记忆中的苹果，才能寻获其他的伊甸残片，拯救地球可能陷入的危机。Rebecca发现Eizo于西元1507年把苹果藏了起来，但读取Eizo当时的记忆时，却发生回忆重迭的现象而无法存取。Shaun Hastings推测Eizo当时的心理困境对Desmond造成反馈，得等到Desmond提高自己与Ezio的同步率，才能顺利进入该段记忆。
为了躲避圣殿武士的侦察，一行人躲进Monteriggioni庄园的别墅，打算在此建立临时基地。Desmond与Lucy跟着Desmond的记忆视觉 前进，找到了庄园外的密道，双人协力解开密道里的机关，并沿着密道一路走回了别墅地下的密室。在密室入口启动Eagle Vision并打开书柜让Rebecca与Shaun进门，大伙在Ezio的秘密基地从新立足。
由于设备需要电力，于是Shaun带着Desmond回到庄园，请他在配电箱上安装电源迴路器。按住y键启动Eagle Vision后，庄园里的配电箱与周边电路会以明亮的白色显示在画面上，只要装好四个电源迴路器，就能让临时基地开始运作。
从此以后，玩家可以随时登入Animus存取Ezio的记忆，回到15世纪末的罗马继续探险，也能随时登出Animus回到现实世界，收发E-mail或与基地里的组员交谈。Desmond也能暂时离开临时基地走进Monteriggioni庄园，收集场景中隐藏的宝物。
登入Animus时，Rebecca会向Desmond讲解Animus的一些新功能，包括考验玩家操控技术的V.R. training，玩家可以在此进行移动、战斗、寻物等各式各样的挑战，玩家持续进行V.R. training也可解开更多额外的挑战。而Desmond除了可随时登入登出Animus，也能切换DNA存取的Ezio记忆段落，并依各段落提示的同 步条件反覆进行任务，提高Desmond与Ezio的同步率。Desmond启动了Animus介面的DNA记忆，进入Eizo记忆的第二区段...
