Ezio 睁开双眼，朦胧看见一名女子正在帮他处理伤口；他立刻立起身子，询问自己身在何方。女子答说有个男人把Ezio留在这里并留下口信，要Ezio到 Mausoleo di Augusto（奥古斯都陵墓）和Machiavelli会面；这个身份不明的男子还帮Ezio准备了替换的衣服与袖剑。
换上衣服、向女子答谢后，Ezio步出屋外。走下楼梯，在导航点的位置找医生治疗伤势，按住RB键不放开启物品栏并使用医疗药（medicine） 后，Ezio爬上附近的教堂顶端，观察附近的地形并找出Mausoleo di Augusto的所在：地图上的老鹰图示代表观察点，通常位于建筑物的最高处；走到观察点的同时，画面右上角的Y键会出现Synchronize（同步） 的提示，此时按下Y键就能解除地图上的遮蔽，显示附近所有的地标、商家的所在，如果玩家在商店购买地图的话，宝箱与Borgia旗帜的位置也会一併显示。从观察点一跃而下（按住RT键不放＋A键），玩家会听到附近的守卫正要修理一名拒捕的市民。一路尾随他们到指定现场再动手杀光他们，再与绞刑台旁的悲伤男子对话。
男子的爱人惨遭绞刑示众，凶手Il Carnefice还恐吓男子不得将尸首解下绞绳，否则要连男子一起吊死。Eizo要男子准备好的时候就把尸体放下，凶手就交给Eizo处理。走上山坡， 再爬到Il Carnefice所在的房子上方，就能在不被察觉的情况下接近Il Carnefice。拉近距离，标定Il Carnefice且画面右上出现X键的Assassinate（刺杀）提示时按下X键就能一击杀害目标。杀死目标后，再打倒周围的敌人就能完成这段记 忆。
朝地图上的惊叹号图示移动，就能在Mausoleo di Augusto前遇到Machiavelli。Ezio原本以为是Machiavelli派人救了他，没想到Machavelli看到Ezio更是讶异，庄园受袭的消息已传开，他甚至以为Ezio已死在攻击之中。
救了Ezio一命的神秘人身分先搁置一旁，Machavelli表示Ezio大难不死的消息绝不能传入Borgia一族的耳中；但在此之前，不过Ezio得 重整身上的装备。Machiavelli给了Ezio点钱，让他到铁匠店买把匕首跟护肩。Ezio认为阿萨辛得挺身对抗整个Borgia家族与圣殿武士， 但Machavelli除了挖苦Ezio说上次会面时他可不是这么说的，还警告他Borgia家族的势力越来越大：除了Rodrigo凶狠毒辣的女儿 Lucrezia外，他的儿子Cesare更是阴险至极、不择手段，更别提他们还得到了法国国王的支持。
一路跟着Machiavelli在城里漫步，目前整座罗马城都在Borgia一族的势力之下，他们掌控了城里的数个重要据点塔楼，藉此监视所有人的一举一动。若Ezio想藉着马匹快速往来于罗马的各个区域，得先除去附近的Borgia塔楼，才能光明正大地利用马厩。
朝地图上代表Borgia塔楼的区域前进，画面上会出现一个红底白十字的符号代表该塔楼的队长。爬上屋顶潜伏接近队长，先杀掉他身旁的两个守卫，再把他抓起 （按B键）丢向旁边的鹰架（抓住时再按B键）就能杀掉他并完成100％同步的条件。回去找Machiavelli，他说光是杀掉几个守卫是没办法让市民愿 意协助他们的，于是Ezio以烧掉塔楼的方式作为讯息，昭告天下此处的Borgia势力已经消失。
登上楼顶、按下B键烧掉塔楼后跟着Machiavelli走到附近的马厩并花钱重建（在招牌处按下Y键），就能骑着马在罗马移动，游戏中随时按一下Y键就能 叫出马匹。两人骑马同行并讨论目前的局势，Ezio认为单单暗杀掉Rodrigo Borgia是不行的，必须将Borgia一族的权利根基彻底剷除才行。Machiavelli怀疑Ezio是否要诉诸人民的力量：他认为诉诸民意就像是 沙洲筑楼，不足仰仗。
正当Ezio回答说阿萨辛兄弟会的关怀核心就是对人性的信念时，一个小贼扒走了Ezio的钱包。Machiavelli笑着 要Ezio赶紧把钱抢回来，他要去Capitoline Hill找个联络人。追上扒手并在奔跑时（按住RT键不放）按下B键就能扑倒对方把钱拿回来，并完成这段记忆。
毁掉borgia塔楼后，Ezio就能购买／重建原borgia塔楼势力范围内的商家与建物，并在这些商家购买物品。每买下一间商店，Ezio就能获得特定 金额的收入，这些收入每20分钟会统计一次并自动汇入银行，玩家可到银行提款。银行有储金上限，收入进帐时如果超过上限将不计，所以玩家得定时到银行提 钱，免得损失白花花的银子。跟着地图上的惊叹号与Machiavelli会合，Machiavelli的联络人Vinicio这时应该已经取得情 报，但迟迟未现身，于是两人跨上马背前去与他会合。骑马行过提托凯旋门（Arco di Tito），数名守卫正要对Vinicio下杀手，Ezio与Machiavelli把守卫杀光、救起Vinicio后，他说情报信仍在旁边的信差身 上，Ezio赶紧追上前去，以追捕扒手的同样方式扑倒信差，把信件夺下。
带着信件走到预定的会合处，Ezio没遇到Machiavelli，却有一群身披狼皮的怪人突然来袭。打倒他们后，可以在附近找到他们使用的祕密入口。8分内完成记忆
这群披着狼皮的人是罗缪勒斯的信徒（Followers of Romulus），玩家可以在这里找到一份Scroll of Romulus，之后可开启一连串的Followers of Romulus支线任务。从罗缪勒斯信徒的藏身处出来后刚好碰上Machiavelli，这群异教徒最近开始扰乱秩序，把市民推向教堂的怀抱，Machiavelli怀疑Borgia一族在背后支援他们。
Ezio 把信交给Machiavelli，并问起了阿萨辛在罗马的支持者；Machiavelli领着Ezio来到一处隧道的入口，玩家之后可花钱修复（在隧道入 口的招牌前按Y键）散佈罗马各处的这些入口，并利用它们迅速前往罗马的各个角落。跟着Machiavelli进入隧道，来到一栋华丽的建筑（其实是仓 库），这里是Fabio Orsini（前作曾出场的佣兵头子Bartolomeo D’Alviano的亲戚）的房子，他把这里借给Ezio与Machiavelli，作为反抗Borgia势力的基地。
有了基地，Machiavelli提议正面进攻Borgia的部队；但Ezio告诉他现在少了苹果、Caterina Sforza被捕，我们对Borgia势力的状况也不了解。同时，Machiavelli也说阿萨辛在罗马本地的地下势力也多受阻碍，佣兵团与 Borgia的法军盟友陷入恶战，妓院的情报支援不够积极，盗贼公会更拒绝与他们合作。于是Ezio亲自出马，分别与佣兵团、妓院、盗贼公会的领袖连络， 并博取他们的支持。
